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Western Blotting印跡膜的選擇
瀏覽次數(shù):6573發(fā)布日期:2012-05-31

除了個別在PAGE膠上利用熒光或者酶活性直接做類似Western反應(yīng)的“前衛(wèi)”方法,印跡法的常規(guī)主流,無論是Southern、Northern還是Western Blot,都需要將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)印到膜上固定,再進行顯色顯影反應(yīng)。對于各種Blot來說,作為承載實驗結(jié)果的載體,包括各類斑點雜交或者克隆轉(zhuǎn)印,膜的選擇就顯得很重要。

    德國老牌的廠家Schleicher & Schuell是世界*個生產(chǎn)硝酸纖維素膜的廠家,其產(chǎn)品標準即為同類產(chǎn)品的行業(yè)標準,產(chǎn)品質(zhì)量毋庸置疑,去年被對手之一的Whatman收購而成為Whatman旗下產(chǎn)品。不過由于這個牌子的產(chǎn)品品種頗多,初次選擇時不免讓人眼花繚亂,上海力敏小編在這里特別介紹一下,便于大家選擇。

PVDF膜

    Westran S:很高的蛋白質(zhì)結(jié)合效率和載量,即使很劇烈的反復(fù)洗滌條件也不影響目標蛋白結(jié)合。0.2μm小孔徑,防蛋白質(zhì)滲漏。zui重要的是,PVDF膜化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,可以兼容測序----將蛋白條帶剪下可以直接去N端測序。如果需要做蛋白質(zhì)測序,PVDF是*選擇。

    Westran Clear Signal:和小S的區(qū)別是孔徑,這個是0.45μm,其他特性一樣,專為蛋白質(zhì)Western用的。由于孔徑大,轉(zhuǎn)移速度也比較快,截留的背景更少,信號就更清晰。CS可以兼容常規(guī)的蛋白燃料,比如麗春紅,氨基黑,靠馬斯亮藍染色。

    PVDF膜用前需要“飄在”甲醇液面浸潤(通風(fēng)櫥操作),然后才能進行下一步。轉(zhuǎn)移方法適用于半干轉(zhuǎn)或者電轉(zhuǎn),其他不適合。而固定的方法主要采用干燥固定。顯色,包括化學(xué)發(fā)光法和同位素,化學(xué)顯色法,都適合PVDF膜。

硝酸纖維素膜:
    Protran:純的硝酸纖維素膜。在所有膜中,Protran膜的封閉zui簡單容易,從而可有效阻斷非特異結(jié)合,降低背景,無需嚴謹清洗即可得到良好的信噪比;廣泛適用于同位素、化學(xué)發(fā)光法、顯色法和熒光法等不同的標記顯色方法,適用于包括Southern,Northern,Western Blot在內(nèi)的多種實驗。對于基于HRP的化學(xué)發(fā)光法印跡反應(yīng),效果尤佳。不過,由于是純硝酸纖維素膜,比較脆,操作上要特別注意。Protran孔徑分為0.45μm;0.2μm;0.1μm這3種。0.45μm膜通常適用于分子量大于20KD的蛋白分子和300bp以上大小的核酸;而0.2μm膜則由于密度大孔徑小能有效減少“滲漏”,更適用于分子量小于20KD的蛋白質(zhì)分子,包括300bp以下的短鏈DNA或者寡核苷酸。而0.1μm膜則是用來對付7KD以下的蛋白質(zhì)小家伙們的。如果你的實驗中的小分子蛋白質(zhì)Western Blot老做不好(比如EGF),大概有可能就是膜的孔徑不夠小,漏掉拉(當(dāng)然電泳Buffer不用甘氨酸也是竅門之一)。硝酸纖維素膜不需要甲醇預(yù)先浸潤,用前直接鋪在在水面滲透潤濕后就可以使用。Protran的另外一個小小優(yōu)點是非常穩(wěn)定,5年前保存Western Blot的實驗結(jié)果在歷時5年后再次做顯色反應(yīng),依然能正確顯色。雖說需要重復(fù)用到5年前結(jié)果的,好像很少見,但能說明其性質(zhì)穩(wěn)定,可保存蛋白質(zhì)。

    在操作上,除了小心之外,Protran硝酸纖維素膜適用于常規(guī)電轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)、真空轉(zhuǎn)、毛細轉(zhuǎn)移,但不適合用堿法。固定方法,如果樣本是核酸,可以用紫外交聯(lián)或者80度烘干固定,蛋白質(zhì)則只需要干燥固定即可。Protran適用于各種通用的顯色方法如化學(xué)顯色,化學(xué)發(fā)光,同位素和熒光法。

    Optitran:夾心的硝酸纖維素膜,中間的聚酯基質(zhì)兩面均勻覆蓋硝酸纖維素,使得該種膜具有硝酸纖維素膜的所有優(yōu)點同時兼具強韌性,特別適合需要反復(fù)操作的實驗,比如需要多次重復(fù)標記雜交和重復(fù)洗脫的實驗----有時候?qū)ν粋€電泳結(jié)果需要Western檢測多個目標蛋白,在檢測*個目標蛋白后,可用酸洗(如0.2MGlycine/0.5MNaCl,pH2.8)2-5min,Tris中和,從而洗脫*個目標蛋白抗體,再進行第二個目標抗體的檢測,Optitran的強韌的高耐受性正好適合這類重復(fù)操作的要求。Optitran膜0.45μm和0.2μm兩種孔徑規(guī)格提供,除了單位面積zui大載量相對Protran會小一些,其他選擇和使用和Protran都是一樣的。Optitran由于帶有聚酯,通常不推薦用熒光檢測。

尼龍膜
  Nytran SuPerCharge:帶高正電荷的尼龍膜。尼龍膜柔軟,強韌,耐折疊,可耐受強度較高的機械操作,這一點上遠勝于硝酸纖維素膜,并因而廣泛用于膜芯片,Macroarray,或者預(yù)制核酸雜交膜上。通常核酸分子在電泳條件下是帶負電,尼龍膜上電荷越高,吸附帶負電的核酸分子的能力越強,不過蛋白質(zhì)荷電特性與核酸不同,尼龍膜更常見用于Southern或者Northern。Nytran SuPerCharge經(jīng)過特殊處理,均勻附著在中間介質(zhì)兩面,表面孔徑均一,電荷量是常規(guī)帶正電核酸膜的3倍,對核酸的吸附更強,更重要的是經(jīng)過特殊處理,克服以往帶電尼龍膜背景高的弱點,能得到良好的信噪比。

    尼龍膜適用于各種轉(zhuǎn)移方法,如電轉(zhuǎn),半干轉(zhuǎn),毛細管,堿法等,固定方法是紫外交聯(lián)。不過就不太適合化學(xué)顯色和熒光檢測。因為尼龍本身有熒光,會干擾結(jié)果;而化學(xué)顯色劑的微小顆粒容易附著而產(chǎn)生斑點背景。

    Nytran同樣分0.45μm和0.2μm孔徑,分別適合300bp以上或者以下的核酸片段。選擇的標準是看你的核酸大小。

    Nytran N是常規(guī)帶正等電荷的尼龍膜。除了荷電小其他特性和差不多,如果你不想要高電荷,這個就是一選擇。

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